E-Mail  






.

PROTEINASA NIa - Aplicacions

Les aplicacions d’aquesta proteïnasa, algunes de les quals encara s’han de comprovar, tenen lloc a nivell del processament de vàries proteïnes per dur a terme l’escissió d’un conjunt més gran. Algunes d’aquestes aplicacions poden ser:

  • Proteines sintetiques que contenen insercions via tècniques de DNA recombinant de la sequencia conservada dels 7 aa s’ha vist que poden reaccionar amb la proteinasa 49 kDa. Això obre portes a que aquest enzim pugui actuar escindint aquestes proteïnes d’entre un transcrit més ampli.
  •  Desenvolupament de tècniques d’auto-processament intracel·lular de proteïnes fusionades per produïr proteïnes solubles natives en E.coli: La sobreproducció de proteïnes derivades de gens clonats usant la fusió de proteïnes d’expressió en vectors en E. coli i en cèl·lules eucariotes ha augmentat la quantitat de proteïna produïda. Aquest mètode s’ha utilitzat àmpliament per la producció de proteïnes solubles recombinants. De totes maneres, una de les grans desavantatges és que l’escissió de la proteïna és un procés llarg, car, i de vegades dóna lloc a productes amb més residus dels que tenia la proteïna original.

    Un nou mètode per la producció de proteïnes natives amb l’extrem amino terminal original in vivo via escissió intracel·lular de la proteïna de fusió és usant la proteïnasa de TEV.  Aquest sistema utilitzava inicialment 2 vectors d’expressió separats, un que produeix la proteïnasa de TEV i l’altre que produeix la proteïna d’interés, la qual també conté el lloc de reconeixement i tall de la proteïnasa. Però va donar problemes a l’hora de tallar in vitro.

    Així que en un esforç per millorar el processament per part de la proteïnasa de TEV de forma intracel·lular, es va trobar que si es feia una fusió de Prot interés-proteïnasa TEV-seqüència diana-GFP-His6 es trobava una eficiència de tall del 100% in vivo, generant Prot interès-proteïnasa TEV i per altra banda GFP-His6. D’aquesta forma es pot obtenir la proteïna amb l’extrem amino terminal de forma nativa. Aquest disseny també és útil si s’utilitza en trans.

    Una qüestió a tenir en compte d’aquest sistema en cis és la potencial interferencia de la proteasa TEV amb el plegament de la proteïna d’interés, ja que la proteïnasa romandría unida a la proteïna. En aquest estudi no es va trobar interferència; de totes maneres, seria apropiat fer un estudi sobre com pot afectar i en cas de que afectés al plegament, aquest problema es podría solventar usant una seqüència d’unió entre la proteïna d’interès i la proteïnasa que després pogués també ser tallada.

  • Crear proteases mutants amb especificitat alterada: amb les estructures cristal·lines dels mutants de la proteasa TEV, sabem quines són les posicions del substrat que interaccionen directament amb el centre actiu de l’enzim. Els llocs S3 i S1 són un repte des del punt de vista de la enginyeria ja que estan directament interconectats. Els pockets S6, S4 i S2 sembla que són les dianes més prometedores sobre les quals fer enginyeria específica.
  • Millorar l’activitat catalítica i l’estabilitat de la proteasa mitjançant enginyeria de proteïnes basda en l’estructura.
  • Interferir als llocs de tall entre les diferents proteïnes del virus TEV de la poliproteïna, per tal d’evitar que el virus es pogués replicar. Aquesta aplicació no és a nivell de l’actuació de la proteïnasa, sinó de poder trobar les seqüències que in vivo fan possible la seva actuació per tal d’inhibir-la i evitar les malalties que causa.
   



BioComputació 2007©. Proteinasa NIa TEV