E-Mail  






. PROTEINASA NIa - Bases estructurals de l’especificitat pel substrat

L’anàlisi de les interaccions entre la proteïna i el lligand ajuda a elucidar els determinants estructurals que fan que la proteasa de TEV tingui tan elevada especificitat pel seu substrat. Esclarir aquests punts d’interacció pot servir de guia per una aplicació biotecnològica tan important com pot ser modificar l’enzim per millorar la seva utilitat.

S’han resolt les estructures cristal·lines de dos mutants de la proteasa del TEV:

  • C151A (mutant inactiu), resolta a 2,2 Armstrongs i també resolt el complex que forma amb el substrat

  • S219D (mutant resistent a la autolísis), resolt a 1,8 Armstrongs i també resolt el complex que forma amb el pèptid producte

 

En la majoria de fets en els que hi ha processament en el cicle dels virus de la Família Picornaviridae intervenen les proteases de tipus 3C, que són estructuralment similars a les Serín-proteases però que utilitzen el grup tiol d’una cisteína en lloc del grup hidroxil com a nucleòfil del centre actiu. Per l’important paper que juguen en la replicació viral, les proteases de tipus 3C són unes dianes importants per la terèpia antiviral.

Totes les proteases 3C presenten una gran preferencia per la Glutamina a la posició P1 dels seus substrats així com per residus petits alifàtics al sublloc P1’, però està clar que aquests no són els únics determinants de l’especificitat de l’enzim. S’ha establert, mitjançant estudis amb substrats oligopeptídics, que els subllocs P6 i P3 també són importants per l’especificitat.

Centre actiu:
Mitjançant la cristal·lografia, s’ha pogut observar que les unions entre l’enzim amb el substrat i amb el producte són molt similars al mateix temps que s’ha vist que el fet d’introduir una mutació a la Cisteína del centre actiu no afecta a la conformació del mateix.

El centre actiu de la proteasa de TEV es localitza entre els residus 189-424 de la proteasa madura. La proteasa NIa adopta un plegament característic de 2 dominis de β-barrel antiparal·lels, també característic de les Tripsin-like Serín-proteases, amb la tríada de residus catalítics d’His46, Asp81 i Cys151 localitzats a la interfase entre els dos dominis.

Es va veure en la co-cristal·lització de l’enzim amb el substrat que, utilitzant el mutant S219D, el substrat havia estat tallat pel centre actiu de l’enzim i que el més gran dels dos productes que s’obtenien del processament quedava unit al centre actiu de l’enzim. No està del tot clar perquè el producte es manté associat al centre actiu al cristall.

Conformació espaial:
Els cristalls obtinguts de les dues proteases mutants contenen dues molècules (A i B) en les seves unitats assimètriques i les interaccions entre aquests dímers són bastant grans. De totes maneres, aquesta proteasa en solució es troba en la seva forma monomèrica i per tant la manera com s’agrupen quan s’analitzen els cristalls no té major importancia.

Les diferencies conformacionals més importants trobades entre els dos mutants és a nivell de les β-hairpin formades pels residus 114-124. Al cristall del mutant C151A, les  β-hairpin de les molècules veïnes interaccionen per formar una fulla β antiparal·lela de 4 cadenes a la interfase del dímer. Les mateixes β-hairpin adopten diferents conformacions en els dos protòmers que formen el dímer del mutant S219D. Aquestes diferencies poden ser atribuïdes a les diferents interaccions creades a l’hora d’agrupar-se al formar el cristall i suggereixen una mica de flexibilitat conformacional en aquesta regió de la molècula.

Tot i que l’extrem N terminal es troba distant del centre actiu de l’enzim, la obvia flexibilitat de l’extrem C terminal i la seva proximitat al centre actiu suggereixen que els talls que alliberen a la proteasa de la poliproteïna són molt segurament intermolecular (en trans) pel que fa a l’extrem N terminal però podrien ser intramoleculars (en cis) pel que a l’extrem C terminal respecta.

Autoinactivació:
Al mateix temps, s’ha observat que aquesta proteïnasa té la capacitat per autoinactivar-se. No està clar si la autoinactivació de la proteasa del TEV juga algun paper a la fisiologia de la infecció viral. Els residus del C terminal que s’eliminen per autoproteòlisis no tenen homòleg en altres Serín o Cisteín proteases. La major part d’aquesta regió que s’elimina es troba desordenada al cristall de les dues proteases mutants, suggerint que no forma part integral del domini catalític plegat.


Hi ha moltes evidencies que indiquen que la autoproteòlisi és una reacció intramolecular, ja que no talla un oligopèptid que conté aquesta regió que s’elimina, tot i que encaixa bé al centre actiu per poder ser tallat, i la teoria de que és una reacció en cis sembla factible des d’un punt de vista estructural, ja que l’enllaç que es trenca es posiciona molt proper al centre actiu de l’enzim.

La mutació S219D redueix la taxa d’autoproteòlisis sense afectar al lloc catalític de la proteasa. L’ordre d’estabilitat de la proteasa està inversament correlacionat amb la eficiencia de processament dels substrats que contenen les mateixes substitucions aminoacídiques a la posició P1’, cosa que indica que l’aminoàcid que es troba a la posició P1’ del lloc intern de tall contribueix al reconeixement entre l’enzim i el substrat d’una forma consistent amb l’elevada especificitat de la proteasa de TEV.

Determinants estructurals de l’especificitat pel substrat:
Estudis bioquímics han establert que els determinants per la especificitat de la proteasa de TEV resideixen entre les posicions P6 i P1’ del substrat, sent els més importants P6, P3, P1 i, en menor mesura, P1’. Per tant, ens centrarem en explicar les interaccions que afecten als residus de P6-P1 i P1’, ja que a més adopten conformacions molt similars en les estructures dels dos cristalls.

La part més important del pèptid, ja sigui el substrat o el producte de la proteasa del TEV, fa grans interaccions en forma de fulla β amb l’enzim.

En ambdós casos, moltes de les interaccions es formen per les cadenes que ocupen les butxaques on s’uneix el substrat S1-S4

El lloc P1 es ocupat per un Gln al substrat de la proteasa de TEV. Tant el N com l’O del Gln de P1 estan implicats en la formació de ponts d’hidrogen amb les cadenes laterals de la His167 y la Thr146 de la proteasa de TEV. El caràcter hidrofòbic de les interaccions es troba conservat. D’aquesta manera es pot explicar el fet del requeriment absolut del residu glutamina en aquesta posició del substrat.

El pocket S2 de la proteasa de TEV només uneix residus hidrofòbics. Aquest pocket està tancat i protegit del solvent.

El pocket S3 de la proteasa està ocupat per una Tyr que adopta dues conformacions alternatives als diferents monòmers, permetent en cada un dels casos establir diferents interaccions hidrofòbiques.

El pocket S4 està ocupat per la cadena lateral d’una Leu que s’involucra en interaccions hidrofòbiques amb la cadena lateral d’altres aminoàcids.

No hi ha pocket S5 a la proteasa del TEV. Per tant, la cadena lateral d’aquesta posició apunta cap a fora de la proteïna. Això està en concordància amb el fet de que qualsevol residu pot ocupar la posició P5 del substrat, amb molt poc o amb gens impacte en l’eficiència de processament.

La proteasa de TEV mostra un gran requisit per Glu a la posició P6 del seu substrat. Aquest residu està involucrat en una xarxa d’interaccions mitjançant ponts d’hidrogen amb l’enzim. Tots els ponts d’hidrogen que conformen la xarxa només es poden formar si la cadena lateral d’aquesta posició és la de Glu, ja que la de qualsevol altre residu interrompria la xarxa.

El pocket S1’ de la proteasa de TEV conté un surc poc profund i tortuós a la seva superfície; en conseqüència, la cadena lateral del residu que ocupa la posició P1’ està parcialment exposada al solvent i no completament amagada dins del complex. L’enzim pot tolerar una gran varietat de cadenes laterals al lloc S1’. Els substrats més eficients s’ha vist que són aquells amb cadenes laterals curtes i alifàtiques, ja que encaixen perfectament al surc.


BioComputació 2007©. Proteinasa NIa TEV