E-Mail  






.

PROTEINASA NIa - Mecanisme d'actuació

In vivo, la majoria dels talls produïts per alliberar les diferents proteïnes que estan formant part de la poliproteïna són catalitzats per la Proteïnasa NIa de 49 kDa. Aquesta proteïnasa funciona en cis (intramolecular) per autoescindirse de la poliproteïna, i en trans (intermolecular) a llocs diana específics. Els llocs proposats per reaccionar la proteïnasa a la poliproteïna són els llocs d’unió entre les proteïnes 50-71, 71-6, 6-49, 49-58 i 58-30 kDa.

Aquestes unions entre les proteïnes són característiques perquè tenen una seqüencia conservada: Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Ser/Gly, on el trencament té lloc després del residu Gln (posició –1) i els aminoàcids denominats com a Xaa corresponen a aminoàcids hidrofòbics o neutres. Els residus conservats dins d’aquest motiu s’han vist que són crítics per una activitat òptima in vitro.

Les activitats de la proteïnasa poden ser testades mentre aquesta és encara part de la poliproteïna, inactivant un o els dos llocs de tall que la flanquegen. El tall en cis a les regions N-terminal i C-terminal de la proteïnasa per escindir-se de la poliproteïna no requereix un ordre específic seqüencial in vitro.

El tall als extrems de la proteïnasa quan aquesta esta formant part de la poliproteïna requereix un mecanisme autoproteolític eficient in vitro. Aquests llocs són refractaris a la proteòlisi quan la proteïnasa s’afegeix en trans. Una possible explicació per aquesta observació és que els llocs de tall autoproteolític són presentats al centre actiu d’una forma acurada i seqüencial per part d’unes proteïnes de plegament concretes i que aquesta exposició dels llocs autoproteolítics a una proteïnasa exògena és restrictiva.

Si es restringeix el tall a la regió amino terminal de la proteïnasa, té poc efecte en el tall en cis a la regió carboxi terminal, i el mateix passa si es restringeix el tall a la regió carboxi terminal respecte el tall a la regió amino terminal. Això fa pensar que el tall autoproteolític d’un dels extrems no necessàriament té lloc per una via depenent del tall anterior de l’altre extrem, sinó que són processos independents i indica que les posicions dels llocs de tall de la proteïnasa en relació amb el centre actiu de l’enzim no estan bloquejades en una conformació rígida abans de l’autoproteòlisi, ja que la orientació fixa d’un dels llocs de tall al centre actiu exclouría la resta de llocs.

S’ha observat que els llocs de talls que flanquegen la NIa així com els llocs interns de tall d’aquesta proteïnasa no són processats de forma bimolecular. Això s’oposa al fet de que si afegim altres llocs diana pel tall de la proteïnasa, són processats de forma molt eficient per l’activitat proteolítica de la NIa en reaccions que forçosament són bimoleculars.

S’han fet diversos experiments per testar més a fons les capacitats que té aquesta proteïnasa, reponent a unes preguntes claus:

1-La proteïnasa NIa del TEV sería funcional fent un processament en cis actuant sobre altres llocs de tall amb la mateixa seqüència incorporats mitjançant enginyeria?
Fent diversos experiments en els que es creen plàsmids recombinants introduïnt a diferents llocs del genoma la seqüencia de tall diana de la NIa, i comparant el processament entre plàsmids que porten la NIa activa i altres que la porten inactiva, podem veure que sempre que es proporcioni la seqüència de tall diana de 7 aminoàcids, la proteasa pot tallar.

2-La proteïnasa NIa inactiva pot ser escindida de la poliproteïna precursora en una reacció en trans (o bimolecular)?
Es van incubar diversos plàsmids que tenien la NIa inactiva (fent-los servir com a substrat) amb una proteïnasa NIa activa i es va veure que alguns dels extrems si que eren tallats mentre que altres no es tallaven. Per tant, el processament en trans d’aquests llocs de tall només es dóna en un cert grau i està influenciat per la seqüència d’aminoàcids que flanquegen la seqüència diana de tall.

Per tant, sempre que es manté la seqüència consens òptima de tall i els aminoàcids flanquejants de la seqüència correctes, la escissió és completa o gairebé completa, ja que el 95% del substrat es processat. En absència absoluta de la seqüència de tall, no es detecten talls.


BioComputació 2007©. Proteinasa NIa TEV