@

 Gram negatives

@

@

El sistema LuxI/LuxR

El sistema de control de la producció de bioluminiscència de Vibrio fischeri mitjançant un sensor de quòrum compost per dues proteïnes, el generador de la senyal LuxI encarregat de la síntesis de la molècula senyal, una AHL, i un activador de la transcripció depenent de la densitat cel•lular LuxR, va ser el primer sistema de detecció de quòrum mitjançant AHL descrit en la seva totalitat, i segueix sent el millor caracteritzat, fet que lfha convertit en el paradigma dels sistemes descoberts posteriorment en altres bacteris Gram-negatius.

El descobriment a principis dels 90 de més sistemes homòlegs a LuxI/LuxR va constituir lfinici dfuna llarga llista (encara creixent) de descobriments de sistemes de comunicació intercel•lulars produïts per AHLs.
En els últims 10 anys sfhan identificat els circuits de detecció de quòrum de més de 50 espècies de bacteris Gram-negatius, i que en la major part dels casos són similars al sistema canònic LuxI/LuxR de V.fischeri. Els circuits identificats per Gram-negatives inclouen, com a mínim, una parella dfhomòlegs dfaquestes dos proteïnes, encara que en alguns casos els sistema és més complicat o esta format per varis sistemes dfhomòlegs.
@

La família de proteïnes generadores de la senyal LuxI és responsable de la síntesis de la molècula senyal : una AHL (lfAI) que és específica per cada espècie i difereix en la seva cadena lateral. La concentració dfaquesta AHL, incrementa amb la densitat poblacional.
Les proteïnes de la família LuxR són reguladores (de la resposta), i sfuneixen a les AHL específiques quan aquestes han assolit una concentració crítica, sent els complexes LuxR-AHL els responsables dfactivar la transcripció de gens sota control de quòrum.

Utilitzant aquest mecanisme, els bacteris Gram-negatius poden acoblar de forma eficient lfexpressió gènica a fluctuacions en la densitat cel•lular.
Per altra banda no tots els bacteris Gram-negatius sfajusten al model LuxI/LuxR.

@


Control de la bioluminiscència en V.fisheri: el paradigma LuxI/LuxR:

La Bacteria marina V.fischeri es troba principalment associada en simbiosi amb diferents hostes eucariotes, que han desenvolupat un òrgan lluminós especialitzat on es troba localitzat el bacteri en estat pur. En aquesta associació, lfhoste proporciona al bacteri un ambient ric en nutrients, mentre que el bacteri li proporciona llum. La llum emesa serà usada amb diferents objectius en funció de lfhoste (exemples: alguns per atraure la parella, altres com a estratègia antidepredadora evitant la creació dfombres en les nits lluminoses, etc).


Lfestabliment de la simbiosis es un procés que involucra un complex circuit dfalteracions fisiològiques (tant en el bacteri com en lfòrgan lluminós) i que requereix un delicat procés de reconeixement i negociació fins arribar a un equilibri.
Se sospita que el sistema de QS que controla la producció de llum, ha dfintervenir en altres operons implicats en la colonització i lfestabliment dfuna elevada densitat cel•lular a lfinterior de lfòrgan lluminós, i de fet, la inactivació del sistema LuxI/LuxR o dels gens de la luciferasa dona com a resultat una colonització deficient de lfhoste. Aquests altres gens controlats per QS però, es desconeixen.


Independentment de la utilització i el tipus dfhoste on es trobi V.fischeri, el mecanisme de producció de llum i el control de lfactivació dfaquest sempre és el mateix: la producció de llum és un procés dfelevat cost energètic, i és catalitzada per lfenzim Luciferasa que precisa de la presència de lfoxigen, ja que lfemissió de llum involucra la oxidació intracel•lular de determinades molècules alliberant-se lfexcés dfenergia en forma de llum. Aquest bacteri ha aconseguit desenvolupar un sistema que li permet activar la luciferasa només quan sfha assolit una densitat celular suficientment elevada com perquè la producció de llum sigui eficaç. En aquest cas, lfòrgan lluminós és lfúnic nínxol en el que lfAI pot assolir la concentració suficient com per desencadenar la producció de llum.

Els gens responsables de la luminiscència en V.fischeri, sforganitzen en dos operons, luxR i luxICDABEG que transcriuen de forma divergent i que estan separats per una regió reguladora de 219bp. Aquesta regió reguladora conté entre altres coses una repetició inversa de 20 bp que constitueix el lloc dfunió de LuxR, també denominada lux box situada a 40 bp de lfinici de transcripció de luxI.


El primer gen de lfoperó lux, luxI i lfúnic gen divergent, luxR, són gens reguladors. El gen luxR codifica la proteïna de 250 aminoàcids LuxR, que és simultàniament el receptor que sfuneix a lfAI i lfactivador transcripcional de lfoperó luxICDABEG.
Lfaltre unitat és lfoperó luxICDABEG, que és activat per LuxR en presència de lfAI de V.fischeri. el gen luxI codifica per una proteïna de 193 aminoàcids responsable de la síntesis de lfAI denominat VAI-1, que al igual que totes les AHLs deriva del metabolisme dels aminoàcids. VAI-1 difon lliurement a través de la membrana, per tant la concentració de AHL és la mateixa a lfinterior i a lfexterior de la cèl•lula. Els altres gens de lfoperó estan implicats en la producció de llum: luxA i luxB codifiquen les subunitats alfa i beta de la luciferasa, lux C, D i E codifiquen components del complex reductasa, etc.
A baixes densitats cel•lulars, el nivell de trancsripció de lfoperó luxICDABEG és baix, i degut a que els gens que codifiquen la luciferasa són contigus a luxI, la quantitat de llum produïda és inapreciable.

A mesura que incrementa el nombre de V.fischeri , VAI-1 sfacumula dins lfòrgan fins assolir el nivell llindar (1-10ƒÊg/ml), que és suficient per què sigui detectat per la proteïna receptora LuxR. Aquesta es troba en el citoplasma i no posseeix cap domini característic dfinserció a membrana, encara que tot sembla indicar que es troba íntimament unida a aquesta, i sembla ser funcional quan es troba formant un dímer.

La interacció entre la AHL i LuxR desemmascara el domini dfunió a DNA de LuxR, el que li permet unir-se al promotor de lfoperó luxICDABE en la zona altament conservada lux box iactivar la seva transcripció. Concretament, VAI-1 sfuneix al domini N-terminal de LuxR i aquesta unió desemmascara el domini C-terminal, que interacciona amb el complex de transcripció i esta implicat en la oligomerització de la proteïna.

Encara que en el sistema canònic de V.fischeri la proteïna LuxR actua com a activador transcripcional dependent de VAI-1, en alguns casos lfhomòleg de LuxR actua com a repressor independent de AI, lfactivitat del qual es veu reprimida per aquest AI.
En V.fischeri hi ha altres vies alternatives dfautoinducció, la qual cosa fa pensar que els circuits de QS en aquest microorganisme són encara més complicats. A més a més, en aquest bacteri, els gens reguladors de la família luxR estan alhora controlats per estímuls ambientals exògens.
La interacció entre factors nutricionals i el fenomen dfautoinducció de la luminiscència en V.fischeri es pot observar fàcilment en el laboratori mitjançant la diferent luminiscència generada per una soca depenent del medi de cultiu.

@


El sistema LuxI/LuxR en altres Bacteris Gram-negatius

Encara que els gens luxI/luxR van ser identificats en 1983-84, es va tardar gairebé 10 anys a començar a identificar sistemes homòlegs en altres bacteris Gram-negatius. Actualment es coneixen més de 50 sistemes homòlegs a LuxI/LuxR, encara que en molts casos es desconeix quins son els gens controlats pel sistema regulador. La principal raó dfaquesta llacuna de 10 anys és que, encara que existeixen algunes regions altament conservades en els gens dfaquesta família, els nivells dfhomologia generalment són bastant baixos, per el que no és possible identificar aquests gens mitjançant tècniques dfhibridació o PCR.

Un exemple de sistema de QS important, és el de Pseudomonas aeruginosa. Actualment és un dels sistemes millor estudiats degut a la seva complexitat i a la multitud de processos controlats per aquest. A més, degut a la seva importància com a patògen i al seu ús com a model de formació de biopel•lícules, la complexa xarxa de QS de Pseudomonas presenta una especial rellevància degut a que utilitza, com a mínim, dos parells de complexes homòlegs de LuxI/LuxR (LasI/LasR, i RhlI/RhlR) que funcionen en tàndem per controlar una gran varietat de gens. Degut a que els gens involucrats en la formació de bipel•lícules es troben sota control de QS en P.aeruginosa, el seu estudi ha estat enormement valuós per aclarir processos de formació dfaquesta: els processos de quòrum no estan implicats en la primera fase del desenvolupament del biofilm en el que es produeix lfadherència (reversible i després irreversible) i la proliferació, sinó que estan involucrats en el procés de maduració (primària i secundària) de la biopel•lícula, per el que és essencial LasR.
@