LES TRANSPOSASES MARINER Hsmar1 i Hsmar2

INTRODUCCIÓ

 

PÀGINA PRINCIPAL

 

OBJECTIUS

 

INTRODUCCIÓ
Els transposons

 

ANÀLISI BIOINFORMÀTIC, RESULTATS I DISCUSSIÓ

 

CONCLUSIONS

 

BIBLIOGRAFIA

 

1. ELS TRANSPOSONS

     1.1. Funció biològica dels transposons i el seu paper en l’evolució genòmica

     1.2. Transposons de DNA

     1.3. La superfamília Tc1/mariner

             1.3.1. L’estructura dels elements mariner

             1.3.2. El mecanisme de transposició

     1.4. Hsmar1

     1.5. Hsmar2

  

 

1. ELS TRANSPOSONS

Els transposons són seqüències de DNA que poden migrar a diferents posicions del genoma d’una cèl·lula, transportant així material genètic entre loci cromosòmics, procés que s’anomena transposició. En aquest procés, es poden produir mutacions i canvis en la quantitat de DNA genòmic. Hi ha una gran varietat d’elements genètics mòbils i es poden agrupar en base al seu mecanisme de transposició. Els elements genètics mòbils de Classe I o retrotransposons, es mouen dins el genoma per transcripció a RNA i posteriorment són retrotranscrits a DNA per la transcriptasa reversa. Per contra, el elements genètics mòbils de Classe II  o transposons de DNA migren directament d’una posició a una altra. L’estructura d’aquests transposons de DNA consisteix en una regió codificant per una proteïna, flanquejada per seqüències terminals. Aquesta proteïna s’anomena transposasa i té funció integrasa, ja que catalitza l’escissió de l’element i la seva re-inserció en un altre lloc cromosòmic.

   Tornar a l'Inici

1.1. Funció biològica dels transposons i el seu paper en l’evolució genòmica

Els elements transposables es troben estesos en la majoria dels éssers vius i formen part d’una fracció important dels genomes dels eucariotes, fet que suggereix que han participat en la organització i l’evolució genòmica. El genoma humà es composa de seqüències de DNA codificants per gens, juntament amb una quantitat significativa de DNA no codificant. La gran variació en la mida dels genomes observada entre les espècies eucariotes és troba, probablement, més relacionada amb la quantitat de DNA repetitiu (com ara elements transposables, DNAs satèl·lit, repeticions de seqüències simples i repeticions en tàndem), que en el nombre de gens codificants.

El genoma humà està format en un 45% per elements transposables del tipus I o retrotransposons tot i que el nombre d’elements capaços de transposar en humans és baix. Els elements Alu, composen un 11% del genoma humà, són els únics retrotransposons actius en humans i es continuen amplificant a un ritme d’una inserció cada 200 nous naixements [10]. Malgrat que els transposons de tipus II o de DNA es troben àmpliament distribuïts en procariotes, són menys abundants en eucariotes. Per exemple, només el 2-3% del genoma humà es composa transposons de DNA i no hi ha evidències de la seva activitat en els últims 50 milions d’anys.

Per propagar el seu genoma en el genoma de l’hoste, els transposons necessiten utilitzar la maquinària cel·lular perquè només aporten els factors necessaris per al reconeixement de les regions que els flanquegen i per a la iniciació dels esdeveniments que permeten la seva propagació a través del genoma de l’hoste. Però a diferència dels retrovirus, els transposons no són infecciosos i per tant, les seves activitats estan restringides a l’espai intracel·lular. Tot i així, els transposons poden afectar la biologia dels ésser vius, ja que el moviment d’un element transposable pot generar mutacions per inserció o alterar la regió promotora afectant l’estructura i regulació gènica d’altres gens, proporcionant així un mecanisme de dispersió de seqüències a nous llocs cromosòmics i actuant com a agent de l’evolució genòmica.

La immensa majoria dels elements transposables de DNA presents en els genomes de vertebrats, no són funcionals degut a la inactivació per mutacions acumulades durant el procés evolutiu, impedint així l’aïllament d’un element utilitzable com a vector de transferència gènica.

  Tornar a l'Inici

1.2. Transposons de DNA

Els elements transposables es poden classificar tenint en compte múltiples criteris, com per exemple, si el mecanisme de transposició és replicatiu o no replicatiu, si es troben en procariotes o en eucariotes, o si el material genètic utilitzat com a intermediari en la reacció de transposició és RNA o DNA.

Els transposons de DNA s’escindeixen i s’integren al genoma sense intermediàri de RNA i són molt diversos en mida, estructura i complexitat. En aquest grup es troben molts transposons eucariotes de Drosophila i d’organismes superiors, incloent vertebrats. Es caracteritzen per dues repeticions invertides flanquejant la seqüència de DNA que codifica per una proteïna que s’anomena transposasa. El mecanisme de transposició és conservatiu, en el qual l’element s’escindeix del locus donador i es re-insertat en una altra regió del genoma. La integració provoca una duplicació de la diana d’inserció, visible com a repeticions directes flanquejant l’element transposat.

La immensa majoria dels elements transposables de DNA presents en els genomes de vertebrats no són funcionals degut a la inactivació per mutacions acumulades durant el procés evolutiu, impedint així l’aïllament d’un element utilitzable com a vector de transferència gènica. Al no disposar de cap sistema endògen actiu en els genomes de vertebrats, es van adaptar transposons d’invertebrats per utilitzar-los en vertebrats. Alguns transposons mostren activitat en espècies filogenèticament distants de l’hoste original. Per exemple, l’element de nematode Tc3 és actiu en zebrafish i l’element Minos de Drosophila transposa cèl·lules de mamífer.

  Tornar a l'Inici

1.3. La superfamília Tc1/mariner

La superfamília Tc1/mariner es troba excepcionalment distribuïda entre els éssers vius, des de protozous a vertebrats, incloent fongs, plantes, ciliats, nematodes, artròpodes, peixos, granotes i humans.

Consisteix en dues famílies:

-La família Tc1 (Tc1-like elements (TLEs)): el primer membre de la qual es va identificar en Caenorhabiditis elegans; Tc1 consisteix en repeticions invertides de 54 bp flanquejant la transposasa  i és actiu en C. Elegans. La seva capacitat de mobilitzar ha estat utilitzada per aïllar gens per mutagènesis insercional i pot ser útil per introduir gens exògens en altres espècies.

-La família mariner (mariner-like elements (MLEs)), en la qual ens centrarem en aquesta web. El primer membre de la família mariner va ser descobert en Drosophila mauritiana. Els elements Tc1/mariner són, possiblement, menys dependents de factors específics de l’hoste que altres elements, com l’element P de Drosophila melanogaster, que no transposa fora del gènere Drosophila. És per això que aquests elements són atractius com a eines per la manipulació genètica d’espècies diferents a l’hoste natural.

La gran majoria dels transposons Tc1/mariner no són funcionals degut a mutacions inactivants, com per exemple, mutacions de canvi en la pauta de lectura, petites delecions o insercions i codons interns de terminació prematura de la traducció, en les regions codificants per les transposases. Aquest procés ha estat anomenat “inactivació vertical”.

Només existeixen dos elements mariner caracteritzats actius, Mos1 de Drosophila mauritiana i Himar1 d’Haematobia irritans. En vertebrats però, no s’ha trobat cap element autònom actiu.

  Tornar a l'Inici

1.3.1. L’estructura dels elements mariner

Els elements mariner comparteixen una organització estructural comuna, consisteixen en una única pauta de lectura oberta d’unes 1300-2400 bp, sense cap intró, que codifica per una proteïna transposasa de 340–350 aminoàcids, flanquejada per repeticions terminals invertides (ITRs) de 20-40bp, que contenen els llocs d’unió per la transposasa. Entre el gen i cada ITR hi ha regions terminals no traduïdes (UTRs), d’aproximadament 150–180 bp per el UTR a 5’ i de 20–45 bp per el UTR de 3’. La seqüència d’aquestes UTRs està menys conservada i conté varis senyals putatius de transcripció. Les transposases mariner es caracteritzen per dos motius aminoacídics altament conservats, [YSPDLAP] i [WVPHEL], i una tètrada [DE,D(34)D], localitzada en l’extrem carboxil-terminal. Les ITRs tenen algunes posicions conservades i tenen el motiu consensus 5’-YYAGRT-3’ a l’extrem.  

Els dominis catalítics, responsables del tall del DNA i de les reaccions d’unió per la transposició, es troben conservats entre diferents elements transposables, evolutivament separats. En les transposases mariner existeixen uns residus DDE conservats, que formen un domini d’unió per ions metàl·lics divalents, com el Mg2+ o el Mn2+ (probablement Mg2+ in vivo), que són cofactors necessaris per el tall del DNA. La conservació d’aquest domini funcional indica que les integrases dels retrotransposons LTR i les transposases dels elements de classe II (DNA) tenen un avantpassat comú.  

Dins dels elements mariner, existeixen dues subfamílies en el genoma humà, Hsmar1 i Hsmar2. És per això que les volem analitzar i comparar, per tal de saber més coses sobre aquests jumping elements que tenim dins el nostre genoma.

  Tornar a l'Inici

1.3.2. El mecanisme de transposició

La transposició és una reacció de recombinació, que es produeix en dos passos seqüencials: el tall específic dels extrems de transposó i la transferència de la cadena, que són catalitzats per la transposasa. En els elements mariner, com per exemple l’Sleeping Beauty, la transposició s’inicia quan la transposasa s’uneix a les seqüències específiques dels extrems del transposó, formant un complex nucleoproteic estable, anomenat complex sinàptic]. Mitjançant talls cohesius a cada extrem de l’element tranposable, l’element sencer és alliberat de la molécula donadora deixant extrems cohesius de 3 nucleòtids a 3´ al lloc d’escissió [35]. El fragment de transposó alliberat també porta extrems cohesius de 3 nucleòtids a 3´, amb radicals hidroxils reactius. Aleshores, l’element escindit s’integra exclusivament en dinucleòtids TA en el DNA diana [36], tenint preferència per certes seqüències que flanquegen els TA [37]. Durant la integració, es produeix un altre tall cohesiu de doble-cadena de DNA, per atac nucleofílic dels grups 3´OH exposats als extrems del transposó. A través d’una reacció de fosforilació, en crea un enllaç covalent entre l’extrem 3´ del transposó i l’extrem 5´ del DNA diana. La reacció d’integració es dóna per l’extrem 3’, de manera que la posició del tall a 5’ només afecta la mida del gap de cadena senzilla que serà reparat posteriorment.

 Model del mecanisme de transposició dels transposons Tc1/mariner

Després de la integració, els gaps de cadena senzilla que flanquegen cada extrem del transposó són reparats per la maquinària cel·lular, de manera que el transposó queda flanquejat per la seqüència diana TA duplicada. La llargada de la duplicació de la diana depèn del tall cohesiu produït durant la transferència de la cadena. El lloc de l’escissió també és reparat, generant la marca de 2-3bp característica dels transposons mariner.

Els elements Tc1/mariner tenen avantatges potencials davant de les tecnologies existents, virals i no-virals, de transferència gènica, ja que tenen pocs requirements en cis per la transposició: són suficients poc més de 250 bp de DNA del transposó (a diferència dels LTRs dels retrotransposons), fet que els fa útils en la creació de vectors per tècniques de “gene trapping.” A més a més, com a requirements en trans, els elements de la família Tc1/mariner només necessiten la proteïna transposasa, ja que és suficient per provocar l’escissió i reintegració de l’element in vitro i es poden realitzar experiments de transposició en espècies diferents al seu hoste, mimetitzant en el laboratori el procés natural de la transferència horitzontal.

  Tornar a l'Inici

1.4. Hsmar1

El primer transposó mariner identificat en el genoma humà va ser Hsmar1, que va ser generat utilitzant 3 seqüències genòmiques i 15 seqüències de cDNA. Representa la còpia activa de l’element ancestral que va envair el genoma de primats fa aproximadament  milions d'anys i el mecanisme de transposició va ser actiu, al menys, durant 37 milions d'anys. La seqüència consensus presenta 1287 bp, flanquejada per dues repeticions invertides perfectes terminals (ITRs) de 30 bp, i codifica per una transposasa mariner de 343 aminoàcids.

Cada còpia ha divergit de la consensus de forma independent i neutral, i la majoria són defectives. Actualment, cap de les còpies presents codifica per una transposasa activa degut a la inactivació mutacional. Les còpies difereixen de la seqüència consensus en un 7,8% en la seqüpencia de DNA i presenten 7,5 indels per kilobase. De mitjana, només un 20% dels 73  llocs CpG hipermutables es mantenen en la seqüència consens. Una excepció remarcabla a aquesta pèrdua de funcionalitat es revel·la en 10 clons de cDNA derivatsd'una còpia genòmica que ha divergit només en un 2,4% de la seqüència consens, ha retingut el 54% dels llocs CpG hipermutables i conté un ORF. La seqüència completa d'una d'aquests cDNAs (NIB1543), indica que el gen d'aquesta transposasa podria haver estat conservat gracies a empalmar-se amb un gen cel·lular codificant pel domini proteinic SET.

Un assaig de PCR específic ha estat utilitzat per revel·lar la presència de còpies de Hsmar1 en tots els primats examinats representant tots els llinatges majors, però no en relatius propers a primats. Existeixen unes 200 còpies de Hsmar1 en el genoma humà, que es troben acompanyades per unes 2400 còpies d’una estructura derivada de les ITR de 80bp i unes 4600 còpies de ITRs aïllades. És per això que es creu que, en el passat, aquest transposó va tenir un considerable efecte mutagènic per inserció en el genomes dels primats.

1.5. Hsmar2

La transposasa humana Hsmar2, va ser el segon element fòssil de la superfamília mariner identificat en el genoma humà. La seqüència consens va ser construïda a partir de 20 seqüències genòmiques senceres i 18 cDNAs de llargada variable, escollides entre les 1000 còpies presents en el genoma. Presenta 1301bp consensus i codificaria per una transposasa mariner inactiva de 351 aminoàcids. Té repeticions imperfectes terminals (ITRs) de 31 bp i presenta 25 CpG hipermutables. S’han identificat múltiples còpies de l’element Hsmar2 en les bases de dades i s’han detectat les seves localitzacions cromosòmiques en el genoma humà per PRINS. Moltes d’aquestes còpies tenen una de les repeticions terminals invertides delecionades i per tant, és improbable que la transposasa s’hi uneixi.

 Les còpies individuals en el genoma humà es troben altament mutades, amb petites i grans insercions i delecions (indels), incloent insercions d’elements Alu de les subfamilies S i J. Les còpies difereixen de la consensus en un 11.6%, presenten 11.8 indels per kilobase (kb) i resten intactes només el 3.7% dels 30 dinucleòtids CpG hipermutables en la seqüència consensus. Aquest nivell de divergència indica que l’ancestre actiu de l’element Hsmar2, representat per la seqüència consensus, es trobava present en el genoma fa 80 milions d’anys.

Arbre evolutiu dels cordats mostrant les espècies en les que s’ha detectat Hsmar2

Els anàlisi filogenètics de les relacions entre les transposases de la família mariner revelen que Hsmar2 està estretament relacionada amb Xtmar1 i Bytmar1, formant un llinatge dins la subfamília irritans. Els elements transposables mariner de la subfamília irritans es troben presents en els genomes de cordats incloent la majoria de craniats, fet que suggereix que aquests elements han estat presents en el genoma de cordats durant 750 milions d’anys i s’han mantingut en aquestes espècies per transmissió vertical. El petit nombre de pèrdues estocàstiques que s’ha observat suggereix la seva inactivació durant l’evolució ha estat molt lenta.

Els anàlisi dels hotspot per la recombinació homòloga en el genoma humà, han revelat la presència del transposó mariner Hsmar2 a prop dels llocs d’intercanvi de cadenes durant el procés de recombinació. Es creu que aquest transposó, i possiblement còpies d’aquest element, localitzades a altres punts del genoma, poden estar implicades en l’estimulació de la recombinació homòloga entre seqüències repetides, a través de la introducció de talls de la doble cadena del DNA a prop de la regió d’intercanvi de cadenes. Aquests processos d’entrecreuament desigual poden donar lloc a la duplicació d’1.5Mb que provoca la malaltia Charcot-Marie-Tooth o a la deleció d’1.5Mb que provoca la neuropatia hereditària.

  Tornar a l'Inici

 

 

Tornar a la pàgina principal